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一、高通量測(cè)序（NGS）實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)介

1.1NGS實(shí)驗(yàn)室又叫高通量測(cè)序檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。NGS是下一代測(cè)序技術(shù)( Next Generation Sequencing)即高通量測(cè)序技術(shù)的簡(jiǎn)稱(chēng)。高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)Sanger測(cè)序（稱(chēng)為一代測(cè)序技術(shù)）革命性的改變, 可同時(shí)對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條核酸分子進(jìn)行序列測(cè)定，同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能, 也稱(chēng)為深度測(cè)序(Deep sequencing)。

1.2由于NGS技術(shù)對(duì)所檢測(cè)的核酸模板進(jìn)行大量擴(kuò)增，容易出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室污染導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性下降；另外NGS技術(shù)要求高、影響因素多，實(shí)驗(yàn)過(guò)程處理不當(dāng)易導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性下降或檢測(cè)失敗。因此臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)驗(yàn)收和規(guī)范化管理是NGS技術(shù)本身需要，也是在臨床上順利應(yīng)用該技術(shù)前提。

二、NGS實(shí)驗(yàn)室臨床應(yīng)用的基本條件

2.1必須擁有符合臨檢中心相關(guān)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)NGS實(shí)驗(yàn)室。

2.2檢測(cè)設(shè)備必須符合標(biāo)準(zhǔn)NGS實(shí)驗(yàn)室設(shè)置要求：高通量測(cè)序儀及配套服務(wù)器；高通量測(cè)序檢測(cè)試劑盒；通用電腦；自動(dòng)分析軟件，實(shí)驗(yàn)室樣本信息管理系統(tǒng)等。

2.3檢測(cè)人員必須通過(guò)專(zhuān)門(mén)的技能培訓(xùn)，并獲得省級(jí)以上衛(wèi)生計(jì)生行政部門(mén)頒發(fā)的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)上崗證書(shū)。NGS實(shí)驗(yàn)室必須建立嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室管理制度、建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序（SOP）、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保實(shí)驗(yàn)室日常運(yùn)行符合國(guó)家衛(wèi)生部的要求，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、確保實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生安全，確保實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行。

2.4NGS臨床應(yīng)用必須在無(wú)菌無(wú)塵環(huán)境下進(jìn)行操作。

三、NGS實(shí)驗(yàn)室建設(shè)基本要求

3.1主體結(jié)構(gòu)

主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內(nèi)所有陰角、陽(yáng)角均采用鋁合金50內(nèi)圓角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問(wèn)題。結(jié)構(gòu)牢固，線(xiàn)條簡(jiǎn)明，美觀大方，密封性好。

3.2標(biāo)準(zhǔn)的各區(qū)分隔和氣壓調(diào)節(jié)

將檢測(cè)過(guò)程分成試劑準(zhǔn)備、樣本制備、PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序四個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)區(qū)。整個(gè)區(qū)域有一個(gè)整體緩沖走廊。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，同時(shí)各區(qū)通過(guò)氣壓調(diào)節(jié)，使整個(gè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染并降低擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)人員和環(huán)境的污染。

可打開(kāi)緩沖區(qū)和PCR 擴(kuò)增區(qū)的排風(fēng)扇往外排氣，在實(shí)驗(yàn)區(qū)的外墻上和各扇門(mén)上都安裝有風(fēng)量可調(diào)的回風(fēng)口，空氣通過(guò)回風(fēng)口向室內(nèi)換氣。

3.3消毒

在每個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)和緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。在各區(qū)還設(shè)置移動(dòng)紫外線(xiàn)燈，對(duì)實(shí)驗(yàn)桌進(jìn)行局部消毒。

3.4機(jī)械連鎖不銹鋼傳遞窗

試劑和標(biāo)本通過(guò)機(jī)械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標(biāo)本在傳遞過(guò)程中不受污染（人物分流）。

3.5地面

地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進(jìn)行清掃，耐腐蝕。沒(méi)有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚（至少800mm×800mm）接縫需要小于2mm。

3.6照明

燈具要選用凈化燈具，能達(dá)到便于清洗、不積塵的特點(diǎn)。

3.7平面布局

NGS實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自己的檢驗(yàn)項(xiàng)目、所采用的檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)和工作量來(lái)決定分區(qū)的多少及各區(qū)域的空間大小，至少具體需要多少個(gè)區(qū)，同樣是“個(gè)體化”的，以“工作有序、互不干擾、防止污染、報(bào)告及時(shí)”作為基本原則。

四、各項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)室建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)

產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷（全基因組低拷貝測(cè)序技術(shù)）

1.實(shí)驗(yàn)室平面圖

圖1：產(chǎn)前篩查與診斷實(shí)驗(yàn)室平面圖

2.  技術(shù)流程圖

圖2：產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)流程圖

3.  技術(shù)參數(shù)

4.分區(qū)功能

4.1試劑準(zhǔn)備室

主要功能：在NGS過(guò)程中使用到的試劑的配制、分裝和保存。

4.2標(biāo)本與文庫(kù)制備區(qū)

主要功能：血液處理、血漿制備、DNA提取、DNA片段化、DNA樣品的純化、DNA濃度檢測(cè)、末端修復(fù)、接頭連接、構(gòu)建樣本的測(cè)序文庫(kù)。

4.3文庫(kù)擴(kuò)增與檢測(cè)區(qū)

主要功能：文庫(kù)構(gòu)建后的PCR擴(kuò)增與純化、文庫(kù)濃度檢測(cè)、文庫(kù)的混合及混合后的質(zhì)檢分析。

4.4測(cè)序區(qū)

主要功能：測(cè)序模板制備（乳液PCR與磁珠富集回收）、上機(jī)測(cè)序、數(shù)據(jù)分析、報(bào)告審核及發(fā)放。

5.儀器配置

5.1試劑準(zhǔn)備室

主要儀器設(shè)備：加樣器、冰箱、分析天平、微量臺(tái)式離心機(jī)、渦旋振蕩器、移液器、可移動(dòng)紫外燈和超凈工作臺(tái)等。

5.2標(biāo)本與文庫(kù)制備區(qū)

主要儀器設(shè)備：冷凍離心機(jī)、微量臺(tái)式離心機(jī)、掌上三管離心機(jī)、渦旋震蕩器、垂直混合儀、移液器、可移動(dòng)紫外燈、生物安全柜、冰箱、托盤(pán)天平、Qubit 2.0核酸定量?jī)x、電腦（可連接互聯(lián)網(wǎng)）、條形碼打印機(jī)、普通打印機(jī)、掃描槍、磁力架等。

5.3文庫(kù)擴(kuò)增與檢測(cè)區(qū)

主要儀器設(shè)備：PCR儀、QPCR儀、Qubit2.0核酸定量?jī)x、可移動(dòng)紫外燈、超凈工作臺(tái)、冰箱、微量臺(tái)式離心機(jī)、渦旋振蕩器、UPS、冰箱、移液器、磁力架等。

5.4測(cè)序區(qū)

主要儀器設(shè)備：高通量測(cè)序儀、PC電腦、打印機(jī)、UPS、恒溫金屬浴、純水儀、冰箱、微量臺(tái)式離心機(jī)、渦旋振蕩器、移液器、超凈工作臺(tái)、可移動(dòng)紫外燈、磁力架、PCR儀等。

n胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（全基因組低拷貝測(cè)序）

1.  實(shí)驗(yàn)室平面圖

圖3：PGD實(shí)驗(yàn)室平面圖

2.  技術(shù)流程圖

圖4：PGD技術(shù)流程圖

3.  技術(shù)參數(shù)

4.  分區(qū)功能

4.1試劑準(zhǔn)備室

主要功能：在NGS過(guò)程中使用到的試劑的配制、分裝和保存。

4.2WGA制備區(qū)

主要功能：基因組DNA釋放、全基因組DNA擴(kuò)增。

4.3電泳區(qū)

主要功能：DNA電泳檢測(cè)及結(jié)果反饋、DNA打斷等

4.4擴(kuò)增一區(qū)

主要功能：DNA片段的末端修復(fù)與純化、接頭連接與純化、文庫(kù)混合、缺口平移。

4.5文庫(kù)檢測(cè)區(qū)

主要功能：文庫(kù)濃度質(zhì)檢分析。

4.6測(cè)序區(qū)

主要功能：測(cè)序模板制備（乳液PCR與磁珠富集回收）、上機(jī)測(cè)序、數(shù)據(jù)分析、報(bào)告審核及發(fā)放。

5.儀器配置

5.1試劑準(zhǔn)備區(qū)

主要儀器設(shè)備：冰箱、分析天平、微量臺(tái)式離心機(jī)、渦旋振蕩器、移液器、可移動(dòng)紫外燈和超凈工作臺(tái)等。

5.2電泳區(qū)

主要儀器設(shè)備：電泳儀、微波爐、凝膠成像儀、冰箱、掌式離心機(jī)、渦旋振蕩器、移液器、可移動(dòng)紫外燈等。

5.3WGA制備區(qū)

主要儀器設(shè)備：PCR儀、超凈工作臺(tái)、冰箱、掌式離心機(jī)、渦旋振蕩器、移液器、可移動(dòng)紫外燈等。

5.4擴(kuò)增一區(qū)

主要儀器設(shè)備：PCR儀、可移動(dòng)紫外燈、超凈工作臺(tái)、冰箱、微量臺(tái)式離心機(jī)、渦旋振蕩器、UPS、移液器、磁力架等。

5.5文庫(kù)檢測(cè)區(qū)

主要儀器設(shè)備：QPCR儀、Qubit2.0核酸定量?jī)x、可移動(dòng)紫外燈、超凈工作臺(tái)、冰箱、微量臺(tái)式離心機(jī)、渦旋振蕩器、冰箱、移液器等。

5.6測(cè)序區(qū)

主要儀器設(shè)備：高通量測(cè)序儀、PC電腦、打印機(jī)、UPS、恒溫金屬浴、純水儀、冰箱、微量臺(tái)式離心機(jī)、渦旋振蕩器、移液器、超凈工作臺(tái)、可移動(dòng)紫外燈、磁力架、PCR儀等。

n遺傳病診斷+腫瘤診斷與治療（雜交捕獲測(cè)序技術(shù)+Sanger測(cè)序驗(yàn)證）

1.   實(shí)驗(yàn)室平面圖

圖5：腫瘤診斷實(shí)驗(yàn)室平面圖

2.  技術(shù)流程圖

圖6：腫瘤診斷技術(shù)流程圖

圖7：一代測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程圖

3.  技術(shù)參數(shù)

4.  分區(qū)功能

4.1試劑準(zhǔn)備區(qū)

主要功能：在NGS過(guò)程中使用到的試劑的配制、分裝和保存。

4.2標(biāo)本與文庫(kù)制備區(qū)

主要功能：樣本接收、樣本前處理、全基因組DNA提取以及各種樣本DNA或者RNA的提取、DNA片段化、DNA純化、DNA濃度測(cè)定、DNA片段的末端修復(fù)與純化、接頭連接與純化。

4.3DNA打斷區(qū)

主要功能：DNA打斷（片段化）。

4.4電泳區(qū)

主要功能：片段化DNA電泳檢測(cè)及結(jié)果反饋。

4.5雜交捕獲區(qū)（擴(kuò)增一區(qū)）

主要功能：目的DNA片段的雜交捕獲與純化，Sanger測(cè)序目的片段擴(kuò)增與純化、Sanger測(cè)序PCR前準(zhǔn)備。

4.6文庫(kù)擴(kuò)增區(qū)（擴(kuò)增二區(qū)）

主要功能：雜交捕獲后擴(kuò)增與純化、文庫(kù)濃度質(zhì)檢分析、及Sanger測(cè)序的PCR擴(kuò)增反應(yīng)與純化。

4.7測(cè)序區(qū)

主要功能：測(cè)序模板制備（乳液PCR與磁珠富集回收）、上機(jī)測(cè)序、及Sanger測(cè)序。

5.儀器配置

5.1試劑準(zhǔn)備區(qū)

主要儀器設(shè)備：加樣器、冰箱、分析天平、微量臺(tái)式離心機(jī)、渦旋振蕩器、移液器、可移動(dòng)紫外燈和超凈工作臺(tái)等。

5.2標(biāo)本與文庫(kù)制備區(qū)

主要儀器設(shè)備：微量臺(tái)式離心機(jī)、掌上三管離心機(jī)、恒溫金屬浴、移液器、可移動(dòng)紫外燈、生物安全柜、冰箱、托盤(pán)天平、Qubit 2.0核酸定量?jī)x、PCR儀、電腦（可連接互聯(lián)網(wǎng)）、條形碼打印機(jī)、普通打印機(jī)、掃描槍等。

5.3DNA打斷區(qū)

主要儀器設(shè)備：Covaris S220超聲波打斷儀、冰箱、掌式離心機(jī)、渦旋振蕩器、移液器、可移動(dòng)紫外燈等。

5.4電泳區(qū)

主要儀器設(shè)備：電泳儀、微波爐、凝膠成像儀、冰箱、掌式離心機(jī)、渦旋振蕩器、移液器、可移動(dòng)紫外燈等。

5.5雜交捕獲區(qū)（擴(kuò)增一區(qū)）

主要儀器設(shè)備：PCR儀、可移動(dòng)紫外燈、超凈工作臺(tái)、冰箱、微量臺(tái)式離心機(jī)、渦旋振蕩器等。

5.6文庫(kù)擴(kuò)增區(qū)（擴(kuò)增二區(qū)）

主要儀器設(shè)備：PCR儀、Qubit 2.0核酸定量?jī)x、微量臺(tái)式離心機(jī)、掌上三管離心機(jī)、渦旋震蕩器、移液器、可移動(dòng)紫外燈、超凈工作臺(tái)、冰箱、磁力架等。

5.7測(cè)序區(qū)

主要儀器設(shè)備：高通量測(cè)序儀、Sanger測(cè)序儀、PC電腦、打印機(jī)、UPS、恒溫金屬浴、純水儀、冰箱、微量臺(tái)式離心機(jī)、渦旋振蕩器、移液器、超凈工作臺(tái)、可移動(dòng)紫外燈、磁力架、PCR儀等。